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博客

蛋白質組學在腫瘤生物標記物發現中的作用

2020-05-04

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探討蛋白質組學在腫瘤生物標記物的發現,特別是癌癥藥物開發中所用生物標記物的發現和分析中不斷演化的作用。

癌癥藥物開發所用生物標記物發現中的蛋白質組學

盡管基因組學已經用于生物標記物的發現很長一段時間 ,但是所發現基因功能的解釋,需要在功能網絡的背景下,借助蛋白質組學的力量進行1。

蛋白質組學生物標記物可以提供蛋白質動態特性的關鍵信息,包括功能、轉譯后修飾、與其他生物分子的相互作用以及對環境因素的反應1。隨著質譜(MS)與其他先進分析技術的發展,蛋白質組學工作流可以以生物標記物發現所需高精確度與高分辨率,對大型數據集進行分析。

蛋白分離技術

蛋白分離和分析的可靠和經驗證方法,是發現蛋白生物標記物的關鍵。復雜蛋白或肽樣本分離的?三種常用技術包括

  • 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)或十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
  • 2D凝膠電泳(2D-PAGE)
  • 高效液相色譜法(HPLC)

下面將詳細討論這些技術。

SDS-PAGE

SDS-PAGE是基于大小分離蛋白的一種常用的一維方法。首先使用變性劑處理樣本,以裂解二硫鍵,然后使用去污劑(SDS),使樣本的蛋白上均勻帶凈負電荷。通過施加電流,去折疊和帶負電荷的蛋白,在凝膠基質(亦即聚丙烯酰胺)上遷移,其中小的蛋白阻力小遷移更快。

在電泳后,使用染料(例如Coomassie綠、SYPROTM Ruby)使凝膠著色,觀察分離的蛋白,然后進行電轉膜,以便進行免疫印跡研究,或者切取凝膠,以便以MS等技術進行進一步分析。

2D-PAGE

然而,對于復雜蛋白混合物的深入分析,特別是生物標記物的發現和開發,一維分離常常不足。將等電聚焦(IEF)與SDS-PAGE技術聯用,可以分別通過電荷與大小分離蛋白。這種二維方法被稱為“2D-PAGE”,由于一次可以分析數千種蛋白,而長期成為蛋白質組學的主流技術2。

正常情況下,根據氨基酸組成不同,蛋白攜帶凈負電荷或者凈正電荷。等電點(pI)是指蛋白質凈電荷為零的pH值??梢岳眠@種特性,使樣本通過一種既定pH梯度電泳(常常是凝膠管或凝膠條),分離蛋白混合物。

在蛋白達到其相應pI后,蛋白遷移停止,即“聚焦”在特定的pH點上。將IEF凝膠插入到傳統的一維凝膠,進行SDS-PAGE的基于大小分離。通過對染色凝膠進行觀察和圖像分析,測量樣本中蛋白的總數目,或者進行“斑點”提取,以便通過MS進行更加詳細的研究。

盡管2D-PAGE已經被廣泛應用,但是仍然存在局限性。例如,一些高酸性或高堿性蛋白難于分離,而低豐度蛋白則不容易檢測到。

HPLC

HPLC是一種高分辨率和高重現性技術。首先使用酶(例如胰蛋白酶)消化蛋白,獲得肽片段,然后與溶劑相混合,使之在高壓下流動,經過內填吸附劑顆粒的色譜柱。市場上可以購買到用于蛋白和肽分析的多種色譜柱,包括針對大小、疏水性、電荷或者特定氨基酸序列等特征設計的色譜柱。

蛋白與吸附劑顆粒相互作用的差異,與從色譜柱上洗脫下來的速率變化相關。通過特定的檢測器(例如吸光度檢測器,如紫外或光度二極管陣列),可以采集這種數據,并將其轉換為色譜圖。

與2D-PAGE相比較,HPLC的敏感性顯著更高,并且動態范圍更寬,可以更好地進行低豐度蛋白的檢測。HPLC還可以與MS聯用,獲得一種強大的蛋白質組學工作流。

其他有用的蛋白分離工具(盡管在此不予討論)還包括毛細管電泳和親和色譜。

不同類型的蛋白質組學平臺

基于MS的方法

蛋白質組學與生物標記物發現嚴重依賴MS。有兩種典型的方案

  1. “自下而上(bottom-up)”方案,先對完整蛋白進行酶法消化,然后使用MS對肽碎片進行表征。
  2. 在“自上而下(top-down)”方案中,由MS對完整的蛋白進行直接裂解,以獲取鑒定序列數據。

盡管存在著多種MS技術和儀器,但是均包括三個主要的部分:(1)一個離子源,(2)一個質量分析儀,(3)一個離子檢測系統。蛋白和肽的電離可以產生帶電荷的氣體離子,后者由質量分析儀基于質荷比分離。由離子檢測系統精確測量質量值及其豐度,生成質譜供分析。

隨著質譜儀的重大創新,出現了配備先進質量分析儀及/或探測器的現代化儀器。這些儀器包括飛行時間(TOF)質譜儀、傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)質譜儀與Orbitrap質譜儀,它們均可以提供非常準確的質量分辨率3。

如上所述,基于MS的技術還可以與不同的技術相耦聯,例如電泳與HPLC。這些聯用可以提供一種協同方案,用于特別復雜的蛋白混合物,對于這種混合物的分析,單獨應用其中任何一種技術均不足夠。

表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI TOF-MS),也稱為“ProteinChip?技術”,是生物標記物發現中廣泛應用的另外一種聯用方案4。這種高通量的技術利用有獨特色譜表面的芯片,基于物理和化學特性(疏水性、親水性、酸性、堿性、表面親合性)分離蛋白。首先經過一個洗滌步驟以去除污染物與未結合的蛋白,然后使用吸能基質使樣本結晶,再使用TOF-MS分析。

SELDI TOF-MS擁有使其成為生物標記物發現中一種有用工具的一系列特征。例如,它需要的樣本量較少,并且可以容易地對一些粗樣本進行分析,例如活檢組織和體液。另外,對于低分子量蛋白的檢測,這種技術也擁有高敏感性。因此,它可以發現其他方法遺漏的生物標記物。

盡管SELDI TOF-MS技術存在一些公認的挑戰(這些挑戰大多與實驗設計差有關)5,但是通過這種技術,已經在多種癌癥類型中,發現了多種潛在的生物標記物。例如,在近期一項研究中,使用SELDI TOF-MS對血清進行譜分析,發現了一小組蛋白,這組蛋白可以將乳腺癌患者與健康對照(包括良性乳腺疾?。┫噼b別6。

基于親和試劑陣列的方法

盡管在蛋白生物標記物發現領域中,基于MS的方法占主導,但是也出現了一些替代性策略,并獲得了推廣。例如,蛋白、抗體與組織微陣列(TMA)方法是進行蛋白檢測和定量的高敏感靶向方案,并且具有多路復用(達 5000-路)能力,可以自動進行高通量樣本分析。盡管在發現過程中,預定義靶點引入了一定水平的偏倚,但是基于親和試劑陣列的方法,具有在不同的樣本類型(例如組織、血漿、細胞系、生物液體/實體)中,對一些經驗證疾病生物標記物進行監測的強大臨床潛力。

已經出現了多種親和試劑,為臨床場景下生物標記物發現與開發提供支持。這些親和試劑包括抗體(如O-link、Myriad、Kiloplex1000)與基于核酸的適配體(如Somascan)7。在這些陣列中,對蛋白水平進行定量的方法包括了傳統免疫分析方案中使用的方法,以至更加先進的基于陣列平臺的統計分析。 

蛋白微陣列主要有兩種類型:

  • 正相蛋白陣列(FPPA)
  • 反相蛋白陣列(RPPA)

在FPPA(通常是指“抗體陣列”)中,將大量的針對不同蛋白靶點的親和試劑(抗體),固定在玻璃陣列玻片上。將被試樣本(例如裂解液、體液)鋪在陣列上,然后通過標記二級抗體,對結合蛋白進行檢測8。

在RPPA中,將被試樣本點在玻璃陣列玻片上,然后將每個陣列與特定抗體相孵育。使用這類蛋白微陣列,可以在一次測試中,測量大量樣本中的一種蛋白,這對于癌癥生物標記物發現與開發來說是重要的。還可以將來自同一裂解液的樣本點在不同的陣列上,然后將這些陣列與不同的抗體相孵育,從而實現多路復用功能8。

與FPPA相比較,RPPA常常是首選,因為后者的信號檢測僅需要一種抗體。另外,還可以在同一陣列玻片上,采用系列稀釋的被試樣本,對信號進行優化,以與分析的動態范圍相擬合。這是重要的,因為抗體親和力受蛋白濃度的影響9。

在臨床上,RPPA平臺已經展現出希望,特別是在與激光捕獲微切割技術相聯用,以評估不同的腫瘤細胞群時。例如,能夠測量HER2受體、相關家族成員(EGFR和HER3)以及下游信號分子的總蛋白與磷酸化(活化)水平的RPPA,可以發現對pan-HER小分子抑制劑有應答的新患者亞組10。

基于抗體與親和性的MS方法

基于抗體的蛋白質組學技術還可以與MS方法聯用,實現兼具免疫分析和MS優勢并且可以高靈敏度對大量蛋白進行快速分析的工作流。這些技術的例子包括抗體富集的選擇反應檢測(SRM)與親和MS11。

親和柱固定抗體的肽富集與MS的聯用,為生物標記物的發現,帶來了很大的希望,特別是對于一些復雜的樣本,例如內含濃度動態范圍大的數千種蛋白的血清。例如,這種方案已被用于開發可以預測乳腺癌患者他莫昔芬耐藥性的檢測方法6。

盡管基于親合性的陣列具有一些已發現優勢,但是這種技術也存在一些挑戰。例如,所產生數據完全依賴于可用抗體。在生物標記物發現的靶向方案中,該問題仍然是一個大問題,因為開發和驗證這些試劑,不是一件小事。大多數基于親和陣列的平臺,僅包括數百種抗體,用于總或修飾蛋白水平的檢測9。因為抗體的特異性不確定,對已經復雜的數據進行解釋有困難,影響廣泛臨床使用的信心。

生物信息學

隨著“~組學”技術的發展,大型數據集正以不斷加速的步伐產生。隨著蛋白質組學技術的持續發展與延伸,一些庫和資源(例如ProteomXchange、PRIDE、GPMdb、neXtProt、ProteomDb、Human Protein Atlas、PeptideAtlas、SRMAtlas、HPP Browser和MissingProteinPedia),將在生物標記物發現的促進中,越加扮演重要作用12。

已經開發出了一些新的計算工具,以減輕大量的現有的蛋白質組學相關文獻的挖掘負擔,為復雜MS實驗的優化提供支持,或者提供急需的大型數據庫處理能力12。

在生物標記物研究與發現的特定生物信息學方法 方面,也做出了大量的工作。這些方向包括處理高維數據集的先進統計工具,以臨床數據訓練和驗證潛在生物標記物的算法,以及將多種生物標記物類型和既往認識相整合的方法13。

未來的蛋白質組學平臺技術

隨著用于靶點定量的經驗證和高特異抗體增多,基于親合性的蛋白質組學平臺將繼續發展。另外,可以鑒別一種蛋白不同蛋白質變體 的更完善親合試劑的開發,將可以進一步推進該技術在生物標記物發現中的應用?3。

對于基于MS的蛋白質組學平臺來說,因為混雜離子造成噪音,低豐度肽的檢測常常是一種挑戰。潛在的解決方案是通過離子遷移譜進行氣相分段。高場非對稱波形離子遷移系統已被證實可以進行肽離子的氣相分離,獲得多電荷簇的富集,從而可以對蛋白質組進行更全面分析14。

毛細管電泳(CE)-MS是HPLC-MS之外的一種肽分析替代和補充策略。因為所需樣本量少,并且具有高可重現性,該技術常用于臨床研究或患者評估中。這種技術還可以檢測親水肽15。CE-MS已被用于癌癥生物標記物的發現,特別是在尿液的譜分析中。例如,在多種癌癥類型中,發現了一組193種肽,這些肽被這些癌癥類型所共有,有可能作為一般原發或復發腫瘤標記物使用16。

還使用基于MS的方法,對CE進行了優化,以對中質量范圍的蛋白進行有效的分析17,并進行微尺度的多維分段(如基于動態pH-界面的CE),以將覆蓋率改善至與2D-LC-CE-MS/MS相似的程度18。

盡管CE-MS在生物標記物的發現中有用,但是這種技術尚未被廣泛采用。至少原因是在蛋白質組學領域中,對LC-MS更加熟悉,并且引入新的CE設備,將帶來相關成本。

結論

癌癥生物標志物是發現和開發新型癌癥療法的關鍵。它們也是臨床實踐中的關鍵要素,可用于風險評估、診斷、預后以及確定治療效果、安全性及/或復發等環節。

腫瘤生物標記物發現中的蛋白質組學技術正處于不斷發展變化中。過去一些年,MS、基于抗體和親合性方法等技術快速發展,開啟了癌癥早期發現和個體化治療策略可用生物標記物的開發之路。然而,將候選生物標記物有效和快速地從實驗室轉化到臨床,仍然是一種挑戰??朔@些挑戰,需要多學科協作,獲取不同領域的支持,采取多組學方法,這樣轉化成功概率才大。

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