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博客

癌細胞系鑒定

2020-04-02

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回顧癌細胞系鑒定的最佳實踐,包括STR和SNP檢測的比較。

鑒定癌細胞系的重要性

臨床前癌癥研究模型——如人異種移植瘤、鼠同種移植瘤、人和鼠細胞系以及類器官——廣泛用于癌癥研究和藥物研發。由于這些模型用于廣泛的應用,因此它們在全球實驗室中經常被大量使用(和共享)。

因此,用于建立這些癌癥模型的細胞系可能很快被污染、交叉污染,甚至被錯誤鑒定。受污染細胞系的患病率估計為20%,最常見的污染物是HeLa細胞,其次是T24膀胱癌細胞。

據預測,每年7億美元的資金將用于使用受污染或被錯誤鑒定的細胞系的研究。這些研究增加了得出錯誤結論的風險,并可能由于研究撤回而損害研究人員的聲譽。細胞系和模型的錯誤鑒定有時也會導致臨床前研究的重現性較差。

在建立腫瘤模型之前,研究人員和CRO實施常規檢測對培養物進行質量控制,從而驗證其身份和質量變得至關重要。雖然多年來一直廣泛推薦進行細胞系認證,但污染、交叉污染和錯誤鑒定仍然是一個嚴重的問題。

這篇文章回顧了兩種最常見的基于基因組的細胞鑒定檢測:短串聯重復序列(STR)和單核苷酸多態性(SNP)檢測,它們的優點和局限性,并審查了身份鑒定的指導原則。

STR或SNP:選擇最佳方法

短串聯重復序列(STR)檢測如何發揮作用?

STR檢測采用引物提取重復的DNA片段,通常為2~6個堿基對。STR對于鑒定人類細胞系特別有價值,因為人類群體中每個基因位點的重復次數不同。因此,STR基因分型可以追蹤人源性腫瘤的遺傳鑒定,包括細胞系來源的或患者來源的異種移植物(PDX)。

美國菌種保藏中心(ATCC)發布了 強有力的指導原則,該指導原則制定了人類細胞系鑒定的STR分析標準。

STR檢測的局限性

STR檢測方法的一個主要局限性是其準確性不高,尤其是用于親屬或具有相近遺傳背景的樣本時。這意味著STR檢測適用于人細胞,不適用于來源于有限品系的近交系實驗小鼠的小鼠腫瘤,因此缺乏容易識別個體小鼠腫瘤模型的獨特標記物。STR分型也不能區分根據同一人類供體建立的細胞系。

什么是單核苷酸多態性(SNP)檢測?

雖然STR傳統上被認為是鑒定的金標準,但由于其局限性,目前正在開發改進方法。高通量測序技術的進展導致形成了穩健且成本效益高的SNP陣列分型檢測。由于提高了準確性,SNP檢測越來越多地用于補充或替代STR鑒定。

SNP檢測取決于人群個體中單個DNA核苷酸的自然變異。例如,SNP可以在特定區域用胸腺嘧啶(T)取代核苷酸胞嘧啶(C)。

SNP可以鑒定小鼠細胞系和人類腫瘤模型,與標準STR分型相比具有核心優勢。通過STR分型錯誤分類的錯配修復(MMR)缺陷型人細胞系也可使用SNP進行鑒定,檢測還可以:

  • 確定性別和種族
  • 檢測病毒感染和支原體污染
  • 鑒定常見免疫缺陷小鼠品系。

STR和SNP檢測的強度和局限性

本文總結了STR和SNP檢測的主要優點和局限性,以供參考。

  優點 局限性
STR

用于鑒定人細胞系

具有已知STR圖譜的數據庫,可將不同實驗室的數據與參考圖譜進行比較。DSMZ (萊布尼茨研究院)和ATCC存儲庫擁有可自由訪問的大型在線圖譜集合,以查找匹配的圖譜。

通常不夠準確,尤其是用于具有親屬關系或相近遺傳背景的情況時(例如,不適用于鑒定小鼠腫瘤模型)

用于DNA降解水平不同的樣本(例如福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織)時不可靠

無法確定是否存在種間交叉污染,也無法鑒定染色體拷貝數畸變

SNP

用于驗證腫瘤模型的高效和穩健的下一代測序(NGS)陣列

適用于小鼠和人腫瘤模型

可用于腫瘤模型采建庫和跟蹤的質量保證

確定性別和種族,檢測病毒感染和支原體污染

缺乏用于識別細胞系的可搜索數據庫

用于身份鑒定的匹配概率的閾值是什么?

判讀鑒定檢測需要匹配標準,以區分“相關”和“不相關”樣本。例如,使用基于STR的“Masters算法”或“替代Masters算法”,匹配百分比≥80%的細胞系通常被認為相關(即來源于同一患者或供體),而匹配百分比為55~80%的細胞系需要進一步分型(例如替代檢測方法)。

匹配算法基于比較兩個細胞系樣本之間共享等位基因的數量,以百分比表示。選擇已鑒定的樣本作為“參考”圖譜,而正在進行鑒定的樣本是“可疑”圖譜。確定兩個細胞系之間匹配百分比的匹配算法如下:

匹配百分比=(兩個STR圖譜中)共有等位基因的數量÷可疑圖譜中的等位基因總數(注:純合子等位基因被視為一個等位基因)

當兩個樣本被認為相關(匹配百分比≥80%)時,必須記住這兩個樣本可能來源于

  • 同一細胞系
  • 同一供體的不同細胞系(例如同一供體的不同組織)
  • 相關細胞系(例如子細胞系或姐妹細胞系)或
  • 可能被錯誤鑒定或交叉污染的細胞系。

由于培養物中的細胞系可能發生遺傳變異,這些算法允許一些變異。根據ATCC(ASN-0002標準工作組)已發表的工作,選擇≥80%作為合適的閾值。它依賴于來自5個細胞庫的相關細胞系樣本中的8個核心位點。這些標準允許使用匹配算法成功驗證98%的相關細胞系樣本。

在少數細胞系中,STR圖譜表現出更大程度的不穩定性,導致匹配百分比<80%。ATCC工作組指出,不相關的細胞系通常顯示匹配百分比為55%或更低?;谠撻撝?,匹配百分比低于56%的細胞系被認為不相關,56~80%的細胞系可能無關,但是需要進一步的數據來肯定地確認或駁斥這一結論。

應該多久鑒定一次細胞系?

雖然目前尚無關于細胞系鑒定頻率的明確指南,但以下幾種情況下需要考慮進行鑒定:

  • 當細胞系來自不可靠的來源時
  • 傳代10代后
  • 制備細胞庫后
  • 有疑問的時候!

總體而言,最好是經常對細胞系進行鑒定,科學期刊和資助機構越來越多地要求提供這些信息。據推測,對于最近未鑒定的任何細胞系,總是至少存在一些疑問。

結論

由于細胞培養在生物醫學研究中的重要性,正確的細胞系鑒定是生成可靠、可重現數據的關鍵。然而,細胞系污染、交叉污染和錯誤鑒定仍然是普遍存在的問題,鑒于全球研究實驗室產生的細胞系數量不斷增加和細胞培養物的高使用率,預計這些問題將進一步擴大。

與鑒定相關的基本質量控制原則存在重大差距,使問題更加嚴重。嚴格的例行鑒定過程有助于確保實驗室使用的是處于最理想健康狀況的正確細胞系。

Topics: Blog, Oncology

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