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非酒精性脂肪性肝炎的飲食小鼠模型:改良AMLN飼料誘導模型與MSNASH小鼠模型的比較

2020-02-03

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比較非酒精性脂肪性肝炎(NASH;包括AMLN和GAN飼料誘導的疾?。╋嬍痴T導小鼠模型與下一代多基因模型的關鍵特征。

臨床前NASH飲食小鼠模型的建立

NASH藥物臨床前開發中面臨的主要挑戰是目前小動物模型的適用性。理想的疾病表現將具有人類NASH的多個特征,包括代謝癥狀和非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD)的先兆。進食西方飲食飼料中的有害成分可誘發疾病。

早期NASH模型開發的重點是為動物提供過量的熱量密度(脂肪形式),以及提供大量的精制糖(特別是果糖)。這些飲食在小鼠中重現了NAFLD樣疾病,但涉及一種多月方案,并且僅達到了輕度至中度的NASH樣纖維化。同時努力引入了炎癥化學損傷和/或微量營養素限制以加劇纖維化,但這些操作損害了純代謝性疾病背景下的可轉化性。

NASH飲食小鼠模型的動物選擇

C57Bl/6(“B6”)譜系小鼠是早期臨床前研究的主要模型,包括肥胖和代謝性疾病的飲食模型。常用的亞系包括原始Jackson Laboratory小鼠(B6J)和NIH亞系(B6N)。這些亞系的不同點在于影響體重增加、胰島素抵抗、氧化應激敏感性等的各種遺傳性變型。

根據歷史經驗,B6J小鼠是使用最廣泛的品系。目前,Taconic Biosciences品系B6N小鼠(“B6NTac”)在肥胖、代謝綜合征、NAFLD和NASH模型中越來越受歡迎。該亞系的脂肪體重增加、胰島素分泌和對B6J的胰島素抵抗均明顯更高,甚至在這些方面還優于B6N祖先譜系。

自從肥胖流行癥出現以后,在野生型B6小鼠中尋找NASH的高轉化模型一直是代謝研究界的追求。近年來,營養科學和畜牧業的突破顯著推進了臨床前NASH模型的建立,并提供了有吸引力的商業選擇,包括通過AMLN和GAN飼料誘導的疾病模型,以及下一代多基因模型。

AMLN飼料

2012年,Amylin Pharmaceuticals的研究人員引入了一種新型肥胖和纖維化小鼠NASH飲食模型 。該模型允許動物自由進食Research Diets Inc.生產的飼料配方D09100301,配方組成如下:

  • 40%千卡脂肪(主要為Primex氫化植物油起酥油,即反式脂肪)
  • 20%千卡果糖
  • 2% w/w膽固醇

該配方通常被稱為AMLN(Amylin Liver NASH)飼料。

進食AMLN飼料的B6J小鼠在12周內出現了快速、穩健的體重增加,大約是標準飼料組(10%脂肪,無果糖或膽固醇)的3倍。這一體重增加傾向于脂肪堆積。

AMLN小鼠出現肝腫大,肝臟達到總體重的8%左右,而標準飼料對照組為4%。12周內循環肝損傷指數(氨基酸轉氨酶)顯著升高。進食AMLN飼料引起的脂肪變性可歸因于D09100301的反式脂肪成分,因為接受等效方案替代飽和豬油脂肪的小鼠在疾病特征譜方面表現出更輕微的癥狀。

在AMLN飼料組中,16周內NASH的組織病理學變化不顯著且變異性較高,而在30周后的變化則較頻繁且為明顯的輕至中度。肝臟特征包括:

  • 大泡性和微泡性脂質蓄積
  • 炎癥浸潤
  • 膠原沉積增強
  • 部位纖維化,包括門靜脈周和竇周。

除達到明顯NASH所需的時間(26-30周)外,異質性也是一個混淆問題。在B6J小鼠中,臨床NAFLD活動性評分(NAS)參數表現出各種疾病嚴重程度。這包括僅在動物亞群中存在的肝細胞氣球樣變。這種變異性非常顯著,足以導致將個體動物分入嚴重程度隊列。這一具有挑戰性的壯舉最好通過侵入性活檢來實現,而后者是一種昂貴且具有技術挑戰性的檢測方法,大多數研究人員都無法實現。

針對進食AMLN 30周的B6J和B6N小鼠的亞系間差異的探索發現了一些表型差異,包括體重增加(B6J < B6N)、肝臟甘油三酯含量(B6J > B6N)和肝損傷的血清生物標志物(B6J < B6N)。NAFLD和纖維化的臨床評分在幅度和變異性方面大致相同,因此沒有通過NIH亞系選擇的快速解決方案。

GAN飼料

近期FDA關于反式脂肪作為食品添加劑的禁令促使了改良AMLN飼料的開發,其中含有Primex的合適有害替代脂肪。繼而開發出了Research Diets Inc.飼料配方D09100310,配方組成如下:

  • 40%千卡脂肪(主要為棕櫚油)
  • 20%千卡果糖
  • 2% w/w膽固醇。

這種飼料通常被稱為GAN(Gubra Amylin NASH)飼料。

與AMLN相比,進食GAN的B6J小鼠出現的體重增加幅度甚至更高。另外,對接受28周GAN和AMLN飼料的B6J小鼠進行了一次頭對頭比較,結果顯示兩飼料組動物的脂肪變性同樣顯著,NAS評分和纖維化程度相當。但是,NAS評分和纖維化蓄積的異質性仍然是同等混雜因素,個體動物表現出明顯不同的分期。因此,補充棕櫚油完全補償了GAN飼料中的反式脂肪,但并未解決模型的局限性問題。

在Taconic Biosciences內部,目前正在努力描繪進食GAN飼料的B6NTac小鼠的特征。早期結果提示良好前景,證實肝病的關鍵階段發生在反映B6J和B6N小鼠歷史特征的時間點。這包括第12周出現的脂肪變性、第20周出現的炎癥和第26周出現的纖維化。

該小鼠譜系是否存在異質性問題仍有待觀察。但是,如果使用該品系解決了這些問題,本組織的目標是提供符合購買方肝病項目理想起始點的現成動物,通過繞過漫長的飲食誘導期,從而促使快速啟動項目。

MS-NASH小鼠

這種新型多基因小鼠品系正逐漸成為代謝和肝臟疾病研究的首選。MS-NASH小鼠可從Crown Bioscience和Jackson Laboratory獲取,該品系小鼠是通過B6J與AKR/J品系的初始雜交產生的。30代以上的選擇性近交產生了一種自發肥胖、胰島素抵抗和高血糖的小鼠品系,該品系小鼠在高脂飲食(60%千卡脂肪)中能夠更快速、更嚴重地觸發這些代謝表型。

MS-NASH小鼠 在進食含果糖的西方飲食飼料的短短20周內,通過代謝失調、肥胖和脂肪變性迅速進展為NASH,配方組成如下:

  • 41%千卡脂肪(主要為黃油)
  • 29%千卡蔗糖
  • 0.21%膽固醇w/w
  • 5%果糖(w/vol),置飲用水中,自由攝入

進食后8周內,肝損傷標志物升高,NAFLD參數可能最短在16周內獲得具有臨床意義的評分,20周內出現纖維化。

鑒于在轉化相關飲食中的誘導時間較短、代謝紊亂的多基因基礎以及廣泛的商業可用性,MS-NASH小鼠預示著臨床前NASH研究的下一個重大突破。

AMLN-GAN飼料誘導模型vs. MS-NASH小鼠模型:頭對頭比較

小鼠品系 C57Bl/6 (J, N, NTac) MS-NASH
肥胖的多基因易感性
飼料 AMLN: Research Diets D09100301
GAN: Research Diets D09100310
Research Diets D12079B與果糖(置飲用水中)
脂肪 40%千卡?
AMLN:主要為Primex反式脂肪?
GAN:主要為棕櫚油
41%千
卡?主要為黃油
果糖 20%千卡 29%千卡,置飼料中(蔗糖)
?5% w/v,置飲用水中
膽固醇 2% w/w 0.21% w/w
開始進食時的年齡 6-10周 6-10周
循環肝損傷標志物 12周 8周
循環肝損傷標志物 12周 12周
NAFLD 20周 16周
纖維化 26周 20周
動物間變異性 AMLN: 是
GAN: 研究正在進行中

上表直接比較了AMLN和GAN飼料誘導的MS-NASH小鼠和NASH模型。與AMLN飼料誘導的單基因模型相比,多基因MS-NASH小鼠中的動物間變異性更低(GAN飼料研究正在進行中)。與AMLN/GAN飼料誘導模型相比,MS-NASH小鼠在短時間范圍內的疾病特征也均很明顯,包括NAFLD、纖維化和循環損傷標志物的證據。

Topics: Blog, CVMD

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